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Jul 23, 2023

Ondas sonoras para resolver el problema de la recristalización en la criopreservación

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7603 (2023) Citar este artículo

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El biobanco de órganos es la asignatura pendiente de la criopreservación. Aunque el problema es multifacético, los avances de las últimas décadas lo han relacionado en gran medida con el logro de un recalentamiento rápido y uniforme de las muestras crioconservadas. Este es un desafío físico ampliamente investigado en el pasado además de los estudios de toxicidad crioprotectores, que también han mostrado una gran cantidad de avances. En este artículo se presenta una prueba de principio, basada en el nematodo Caenorhabditis elegans, de una tecnología capaz de realizar tal función: los ultrasonidos focalizados de alta intensidad. Así, evitando el problema de la recristalización, este gusano, en su estado adulto, conservado a − \(80\;^\circ{\rm C}\), ha sido devuelto sistemáticamente a la vida tras ser calentado con Ultrasonidos Focalizados de Alta Intensidad (HIFU) ondas. La gran ventaja de esta tecnología es que es escalable; además, el recalentamiento puede ser monitoreado en tiempo real por termografía MRI y puede ser controlado por interferometría acústica. Anticipamos que nuestros hallazgos son el punto de partida para un posible enfoque de recalentamiento que puede usarse para la crioconservación de sistemas a escala milimétrica: ya sea solo o en combinación con otras formas prometedoras de calentamiento, como nanocalentamiento o calentamiento dieléctrico, la tecnología actual proporciona nuevas formas de resolver los aspectos físicos del problema de la recristalización en la crioconservación, abriendo la puerta al almacenamiento a largo plazo de muestras más grandes.

La conservación de órganos en bancos a bajas temperaturas ofrece innumerables oportunidades1,2. Actualmente, esta posibilidad ha permanecido esquiva, con solo algunos éxitos parciales y aislados, es decir, en riñón de conejo, ovario o hígado de oveja3,4,5. Aunque existen diferentes estrategias de criopreservación, para el almacenamiento criogénico de órganos a largo plazo, el daño causado por la eventual aparición de cristales de hielo es en gran parte responsable de esta situación. En los siguientes párrafos intentaremos enmarcar el problema dentro del contexto general de la criopreservación. A continuación, entenderemos por qué un recalentamiento rápido y uniforme logra evitar esto. Finalmente, veremos cómo el ultrasonido focalizado de alta intensidad es capaz de ofrecer la solución.

Ya en 1940 Luyet6 entendió bien que la cristalización de los sistemas biológicos era posible simplemente cruzando la zona donde podía aparecer el hielo a una velocidad suficiente. Esto se representa simbólicamente en la Fig. 1: cuando la temperatura sube o baja, pasamos de una fase a otra; sin embargo, podemos saltarnos una determinada fase si el cambio de temperatura es lo suficientemente rápido. Así, podemos pasar de líquido a vidrio, y viceversa, sin pasar por el estado cristalino; para ello basta que el tiempo característico de esta transición sea menor que el tiempo característico requerido para la nucleación y crecimiento del hielo.

Efectos de las tasas de enfriamiento y calentamiento en el cambio de fase de un sistema acuoso. El eje horizontal representa la temperatura en Kelvin, con las temperaturas de transición entre los cuatro estados (vidrio, cristal, líquido y gas) etiquetados como Tvidrio (temperatura de transición vítrea), Tmelt (temperatura de fusión) y Tboil (temperatura de vaporización). Este eje se puede recorrer en ambos sentidos, correspondiendo a los cambios de estado al cruzar las temperaturas marcadas. El eje vertical representa la velocidad a la que se produce el cambio de temperatura. De manera ilustrativa se representa la disposición de las moléculas del sistema para los cuatro estados mencionados. En este diagrama es de especial interés la velocidad a la que atraviesa las temperaturas marcadas, siendo la más relevante para el tema que nos ocupa el paso de estado líquido a vítreo. Un cambio de temperatura excesivamente lento (valores bajos en el eje vertical) para pasar de la fase líquida a la vítrea, y viceversa, implica el necesario paso por la fase cristalina, lo que en sistemas acuosos implica la formación de hielo. En cambio, las altas tasas de enfriamiento y/o calentamiento (valores altos en el eje vertical) pasan por alto la región "cristalina", dando un cambio directo entre los estados líquido y vítreo.

El problema con el que se encontró Luyet fue que esas tasas de enfriamiento y calentamiento a menudo eran imposibles de alcanzar en sistemas de más de unas pocas decenas de micras. Aunque era consciente de que estas tasas podían reducirse con la adición de solutos, decidió explorar un camino diferente: el de intentar conseguirlas mejorando la transferencia de calor. Por lo tanto, solo pudo salvar una pequeña cantidad de pequeños sistemas biológicos a través del proceso.

No fue hasta el descubrimiento del glicerol7 que estas velocidades estuvieron dentro de lo técnicamente factible. Para ello es fundamental la deshidratación que produce el hielo extracelular8,9. Es la técnica conocida como congelación lenta que actualmente se utiliza en miles de laboratorios.

Posteriormente, la aparición de otros crioprotectores ha propiciado el desarrollo de alternativas a la congelación lenta. Estos no necesitan hielo extracelular para lograr la cristalización del interior celular. Debido a esta ausencia total de hielo, tanto en el interior como en el exterior de las células, reciben el nombre genérico de técnicas de vitrificación. En este caso, es común distinguir entre vitrificación de equilibrio y de no equilibrio, a saber. En la vitrificación en equilibrio —según Farrant10— se añaden al sistema concentraciones crecientes de crioprotector a medida que desciende su temperatura, mimetizando así, en cierta medida, el efecto del hielo extracelular en la congelación lenta. Dada su toxicidad11,12, la cantidad de crioprotector para cada temperatura se mantiene al mínimo, lo justo para evitar la formación de hielo, siguiendo el diagrama de equilibrio termodinámico sólido-líquido; de ahí su nombre10,13,14,15. En cambio, en la técnica conocida como vitrificación de no equilibrio, todo el crioprotector se añade desde el principio, o en un número reducido de pasos, pero siempre, por lo general, a temperaturas por encima de cero y en concentraciones capaces de alcanzar la vitrificación por simple inmersión. la muestra en nitrógeno líquido16,17. Obviamente, hay estrategias intermedias. En ellos, la concentración de crioprotector no sigue la línea del diagrama de fase, sino que se mantiene dentro de la banda acotada entre la posibilidad de subenfriamiento y el límite de toxicidad3,18; o se juega con la compatibilidad de la vida con una moderada aparición de hielo19,20. En resumen y centrándonos en lo que aquí nos ocupa: (1) las técnicas de criopreservación se diferencian fundamentalmente en la cantidad de crioprotector que tiene el sistema para cada temperatura; (2) dicha cantidad de crioprotector rige la posición, el ancho y las velocidades a las que se debe cruzar esta zona de la Fig. 1 en ambas direcciones para evitar la formación de hielo21; y (3) en cualquier caso, esta cantidad de crioprotector se mantiene al mínimo, dada su toxicidad. Con todo esto, a día de hoy, el problema se centra en la optimización de tres factores: la transferencia de masa, la transferencia de calor y la toxicidad de los crioprotectores. Y aquí es donde entra en juego fundamentalmente la geometría y las dimensiones del sistema, y ​​en consecuencia, el origen de la dificultad de criopreservar órganos: con sistemas pequeños se pueden conseguir velocidades de enfriamiento/calentamiento muy altas y así mantener la concentración. de crioprotector bajo22. Sin embargo, cuando los sistemas son grandes, es más difícil alcanzar este equilibrio entre toxicidad y transferencia de calor, por lo que es frecuente que el hielo aparezca de forma letal, tanto en los vitrificados por congelación lenta23 como por vitrificación4,24, aunque generalmente con parámetros muy diferentes. valores, pero el origen del problema es fundamentalmente el mismo en los dos casos.

Paradójicamente, es más fácil evitar la formación de cristales de hielo letales durante el enfriamiento que durante el calentamiento21. El origen de este curioso comportamiento reside en la existencia de una doble necesidad para la aparición de dichos cristales: la de su nucleación y la de su crecimiento. Debido a que el crecimiento requiere baja viscosidad, ocurre preferentemente a altas temperaturas. Sin embargo, la nucleación es más probable a temperaturas muy bajas, generalmente cerca de Tg (típicamente \(\sim -100 \; ^\circ{\rm C}\) para soluciones y \(\sim -47 \; ^\circ{ \rm C}\) para celdas25). Así, cuando un sistema se enfría, primero cruza la "zona de crecimiento", pero por ahora no hay "nada que crecer" (todavía no hay núcleos). Solo después, se alcanza la zona de nucleación y pueden aparecer pequeños embriones de hielo que no crecerán, y por lo tanto no son letales en principio. Finalmente, el sistema cristaliza y se almacena. Sin embargo, cuando se vuelve a calentar, puede producirse una recristalización (o incluso una desvitrificación)26. El recalentamiento comienza atravesando, y por segunda vez, la zona de alta nucleación, con la posible aparición de nuevos embriones; de hecho, Boutron27 señaló la presencia de \({10}^{6}\) a \({10}^{12}\) veces más núcleos al recalentarse desde el estado amorfo que al enfriarse desde el estado líquido. Finalmente, se vuelve a cruzar la zona de crecimiento, donde ahora habrá un número considerable de núcleos oportunistas que pueden crecer hasta un tamaño letal. Estos cristales, que son más numerosos, como decimos, durante el recalentamiento, ven favorecido su crecimiento a medida que aumenta la temperatura28. La forma de evitar este crecimiento es cruzar esta zona muy rápido. Es por eso que una tasa de calentamiento alta es crucial y, en cierto sentido, más importante que la tasa de enfriamiento; Recientemente se ha destacado la relevancia del recalentamiento como un cambio de paradigma en la criopreservación24. El lector interesado puede encontrar en la bibliografía un análisis profundo y detallado de los temas desarrollados en este párrafo29.

En los sistemas criopreservados por congelación lenta, como es este estudio, a diferencia de la vitrificación, el problema de la recristalización y la consiguiente necesidad de altas tasas de calentamiento, se ha identificado consistentemente en todo tipo de situaciones. Esto ha llevado a la recomendación de altas tasas de calentamiento dentro de los Good Manufacturing Processes (GMP)30,31. Así, es bien conocido cómo, de esta manera, se evita la recristalización en muestras que van desde el tamaño de espermatozoides32 hasta bolsas de sangre30, incluso incluyendo crioviales en terapia celular33. Recientemente se ha estudiado un caso de interés en el contexto de CAR-T34, donde estudios conjuntos de criomicroscopía y calorimetría han identificado el beneficio de altas tasas de calentamiento para evitar la recristalización.

Para conseguir altas velocidades de recalentamiento se han propuesto diferentes formas de aplicación del campo electromagnético dada su capacidad penetrante y, por tanto, en principio escalable. Esta solicitud se ha hecho directamente35,36,37,38 o indirectamente a través de un agente mediador39,40,41. Importantes avances en esta materia se han hecho recientemente42. Se puede encontrar una tabla que compara los diferentes métodos de calentamiento volumétrico en Información complementaria.

Una alternativa al campo electromagnético, también penetrante43, son los Ultrasonidos Focalizados de Alta Intensidad (HIFU)44. El origen de aplicación de HIFU data de 192745, donde ya se hablaba de que era un campo con un amplio abanico de posibilidades a investigar. 15 años después los primeros tumores estaban siendo quemados por el intenso calor generado por estas ondas46. Sin embargo, no fue hasta el desarrollo de NMR47 que las técnicas de imagen permitieron el control de HIFU basado en la termografía MRI. Hoy en día, existe una amplia gama de configuraciones (secuencias) de resonancia magnética disponibles que permiten obtener imágenes térmicas 3D para muchos tejidos en diferentes circunstancias48. Por otro lado, cabe señalar que la atenuación y penetrabilidad del ultrasonido es función de su frecuencia (por ejemplo, a 1 MHz la onda de ultrasonido se atenúa aproximadamente un 50% al propagarse a través de 7 cm de tejido blando, y a 2 MHz la onda se reduce a aproximadamente un 25% de su valor inicial por el mismo tejido43). Por lo tanto, para muestras de gran tamaño, es recomendable tener una matriz de transductores, ya que esto mejora la penetración efectiva de la onda y la escalabilidad al controlar las fases relativas de la onda de cada canal, lidiar con cambios en el biomaterial y falta de homogeneidad (fracturas, hielo, …) en tiempo real. En este trabajo utilizamos un solo transductor (muestras de tamaño mm); en simulaciones por computadora anteriores exploramos veintiséis transductores (tamaño cm)44. Hoy en día son habituales los dispositivos formados por miles de transductores, que permiten calentar con precisión superior a una décima de grado en multitud de terapias médicas49.

Nuestro grupo de investigación ha publicado recientemente44,50 el resultado de simulaciones por ordenador de HIFU para recalentamiento en criopreservación con la promesa de ponerlo en práctica en el presente trabajo. Para ello hemos utilizado el C. elegans como prueba de principio. La criopreservación convencional de C. elegans23,51 se ve afectada por el problema de la recristalización, manteniendo bajas tasas de recuperación en los estadios larvales más pequeños—L1 y L2—(35%), y prácticamente nulas en el estadio adulto51. Sin embargo, si el recalentamiento es rápido, esto no ocurre52. En las siguientes líneas mostramos, por primera vez, la presentación de HIFU para evitar el problema de la recristalización en base a este gusano. Para ello, se cultivaron nematodos N2 en condiciones habituales, a \(20\;\mathrm{^\circ{\rm C} }\). Con la población estabilizada luego de al menos 5 generaciones, se procedió al proceso de criopreservación. Para el recalentamiento se realizaron siempre dos grupos: un grupo control, recalentado de forma estándar23,51, y otro experimental, recalentado con ultrasonido. En los siguientes párrafos se describen los desafíos técnicos que hubo que superar, los detalles de los experimentos realizados y, finalmente, los resultados obtenidos.

Como mencionamos, antes de llevar a cabo los experimentos, hubo que abordar una serie de desafíos prácticos. Así, se construyó un dispositivo HIFU a partir de un generador de onda cuadrada utilizando cuatro transistores de potencia con sus respectivos drivers, un oscilador de 1,22 MHz, un microcontrolador y diversos elementos pasivos. Este generador de ondas acepta una potencia de puente de transistores de hasta 200 W proporcionada por una fuente externa y suministra la excitación al transductor HIFU. El transductor HIFU es un casquete esférico PTZ-8 de 50,8 mm de radio de curvatura y 10 mm de profundidad de casquete que se basa en el efecto piezoeléctrico para convertir la excitación eléctrica de onda cuadrada en una oscilación mecánica, es decir, en ondas de presión, con amplitud proporcional a la raíz cuadrada de la potencia utilizada. La tapa está en una cámara sellada, descrita en la Fig. 2a. La frecuencia de resonancia de la tapa de cerámica fue de 1,5 MHz, aunque se alimentó a una frecuencia más baja, como se ve en la salida del generador que se muestra en la Fig. 2b, para superar el posible cruce en los transistores del generador. El foco donde se concentra el ultrasonido, que depende de la forma y dimensiones del transductor, se determinó de forma independiente con tres métodos diferentes: por termografía con bolómetro, por termografía con película termosensible y con termopares. Las mediciones buscaron determinar la distancia en el eje z que se ubica el centro de la región focal. Para obtener valores precisos se utilizaron los motores paso a paso de una impresora FDM CREALITY Ender 3-Pro para controlar la posición de la punta del termopar, con una precisión de 100 µm. Los experimentos térmicos realizados a diferentes distancias de la superficie del casquete (ver Fig. S5) arrojaron una posición del foco a 50,8 mm con respecto al mismo, siendo este el punto de máximo calentamiento. Esto está en perfecto acuerdo con lo que se espera según la geometría del transductor detallada anteriormente.

Caracterización del equipo de Ultrasonido Focalizado de Alta Intensidad. (a) Sección del transductor HIFU. A–D: Chasis de PVC, para dar estructura, estanqueidad y cámara de aire detrás de la tapa; E: película conductora para la superficie exterior de la tapa; F: película conductora para la superficie interior de la tapa; G: sellador epoxi (externo e interno); H: cable coaxial de alimentación; J: cámara de aire; K: tapa de bola de cerámica PTZ-8; L: tapón de vaciado de la cámara de aire en caso de infiltración. (b) Salida del generador de onda cuadrada, sin fuente de alimentación de la fuente externa. La frecuencia de la señal es de 1,22 MHz, con una amplitud de 18 V pico a pico. (c) Curvas de temperatura obtenidas por calentamiento con HIFU a diferentes voltajes y corrientes de la fuente de alimentación externa. Las tomas se normalizaron para 60 s de exposición. Las tasas de calentamiento obtenidas dependieron de la fuente de alimentación de la fuente externa. Como la potencia nominal del piezoeléctrico es de 25 W, operar por debajo de ella (caso de la curva para 20 V y 0,68 A) reduce el rendimiento. ( d ) Detalle de la región focal del calentamiento ultrasónico. La transferencia de calor es máxima en una región ovoide de dimensiones 12 × 15 mm. Estos valores se obtuvieron de los experimentos por termografía con película termosensible, cuyo ejemplo se muestra en (e). (e) Perfil termográfico de calentamiento con HIFU en agua a temperatura ambiente. El calentamiento produce, en la sección, círculos concéntricos respecto al foco. Entre el punto más caliente y el más frío, siempre se registra una diferencia de temperatura de menos de \(10 \;^\circ{\rm C}\).

Con diferentes voltajes (en el rango de 20 a 60 V) y corrientes (en el rango de 680 mA a 2,26 A) de suministro de CC para el generador de olas, el transductor obtuvo las curvas de calentamiento reflejadas en la Fig. 2c, variando la fuente de alimentación. Las tasas de calentamiento alcanzadas por el dispositivo, en las diferentes potencias de suministro, fueron aproximadamente entre 14 y 218 \(^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\). A continuación, se caracterizó la forma de la región focal, como el volumen en el que en cualquier instante durante el recalentamiento, la máxima diferencia de temperatura entre dos puntos cualesquiera fue siempre menor que \(10 \; ^\circ{\rm C}\). Esto resultó en un ovoide de dimensiones 12,4 × 15,4 mm. Estos valores se pueden ver en la Fig. 2d y e.

Para garantizar que toda la población de nematodos, empapada en la solución crioprotectora, quedara confinada dentro del foco de ultrasonido, se tuvo que criopreservar en un pequeño contenedor especialmente diseñado. Dicho contenedor consistía en un pozo hueco, construido dentro de una placa de Petri, utilizando agar como relleno para el resto. Su detalle se muestra en la Fig. 3d. Se decidió que las dimensiones del pozo fueran de 9 mm de diámetro por 6 mm de profundidad, menos que las dimensiones del ovoide focal. Para asegurar la ausencia de fugas del medio crioprotector a través del agar, las paredes del pocillo se cubrieron con una película de alcohol isopropílico. La eficacia del tratamiento fue confirmada por experimentos de permeabilidad de estos pocillos, revelados por el paso -o no- del rojo fenol, como tinción, a través del agar. Estos pozos personalizados sirven simplemente como un contenedor de confinamiento adaptado a nuestra geometría; También se pueden utilizar materiales y formas alternativos, siempre que sean capaces de transmitir ultrasonidos. Finalmente, antes de enfriar, las placas siempre se cerraron con su tapa y se sellaron con parafilm. Esto permite el uso de nuestra tecnología de acuerdo con las GMP, ya que la muestra está aislada. Para el recalentamiento con ultrasonido se eligió etilenglicol como medio líquido para la transmisión de ondas sonoras desde el transductor a la muestra. Este medio puede mantener a los nematodos inicialmente en − \(80 \; ^\circ{\rm C}\) permaneciendo en estado líquido incluso a temperaturas suficientemente bajas.

Historia térmica para la crioconservación y configuración experimental de C. elegans. (a) Curvas de temperatura durante el proceso de congelación lenta, el almacenamiento a \(- 80 \; ^\circ{\rm C}\) (representado por el "gap" en el gráfico) y la recuperación por calentamiento HIFU. Las muestras comienzan a temperatura ambiente y, después de la incubación en solución crioprotectora durante 10 min, se colocan en el congelador a \(- 80 \; ^\circ{\rm C}\) para un enfriamiento a \(- 0.6 \; ^ \circ{\rm C} /\mathrm{min}\). Luego se almacenan durante 48 h y se recuperan mediante calentamiento por ultrasonidos directamente desde la temperatura de almacenamiento, hasta una temperatura de aproximadamente \(-5 \; ^\circ{\rm C}\). (b) Configuración experimental que muestra A: baño de etilenglicol en \(-70 \; ^\circ{\rm C}\); B: transductor HIFU; C: soporte placa en PLA; D: placa Petri (con pocillo en el centro) tapada, sellada con parafilm e invertida; E: termómetro externo; F: generador de onda cuadrada; G: fuente de alimentación externa. ( c ) Vista en sección 3D de la configuración experimental, modelada en CAD. En esta imagen se aprecia mejor la función del soporte y su uso. Las etiquetas se comparten con la imagen (b). (d) Detalle del pozo de agar en una placa de Petri de 50 mm de diámetro. La placa se presenta invertida, que es como se coloca sobre el soporte 3D para ser expuesta a los ultrasonidos.

La necesaria inmersión del transductor HIFU por su parte cóncava en el baño generaba frecuentemente una indeseable burbuja de aire. Estos fueron eliminados por medio de un aspirador de gas sumergido en el etilenglicol. Finalmente, la repetibilidad de los experimentos y la estabilidad de la posición del foco con respecto a la muestra calentada se garantizaron con la construcción de un soporte de ácido poliláctico (PLA) impreso en 3D que aloja e inmoviliza de forma segura la placa de Petri y el transductor, fabricado con técnicas CAD y FDM. Las Figuras 3b y c muestran la configuración experimental para el uso de HIFU con las placas fabricadas. Los detalles sobre los modos de falla y la practicidad del calentamiento se pueden encontrar en la Información Suplementaria.

El rendimiento físico de toda la configuración descrita anteriormente se modeló computacionalmente usando elementos finitos (Comsol Multiphysics v6.7), usando juntos los paquetes de Acústica y Transferencia de Calor. El resultado de estas simulaciones por computadora corroboró tanto la posición del foco y sus dimensiones, como las tasas de calentamiento encontradas experimentalmente. Los campos de presión de sonido y temperatura en una vista 2D del experimento se muestran en la Fig. 4e y f, respectivamente. La Figura S10 proporciona una descripción general de los contornos isotérmicos durante una simulación de calentamiento de 60 s.

Presentación de resultados. ( a ) Supervivencia con HIFU según la tasa de calentamiento y el tiempo de exposición. Las bajas tasas de calentamiento muestran peores resultados en la recuperación de C. elegans. Los experimentos se realizaron siempre con placas que contenían grupos de \(\sim 200\) nematodos. Estos mostraron la siguiente composición promedio: 20% individuos en estadio L1, 30% en L2, 25% en L3, 15% en L4 y 10% adultos. Para los parámetros óptimos, la supervivencia por etapas de crecimiento no fue homogénea, ya que se recuperaron más nematodos L1-L3 que L4 y adultos. La supervivencia de L4 fue del 70%. La supervivencia de los adultos estuvo entre el 40 y el 60%. (b) y (c) Muestre la supervivencia para las tasas de calentamiento más altas, \(157.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) y \(217.8 \;^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) , en función del tiempo de exposición. Los tiempos de exposición cortos (menos de 50 s) y excesivamente largos (más de 70 s) dieron como resultado tasas de supervivencia muy bajas. (d) Dependencia de con la tasa de calentamiento para el tiempo de exposición óptimo. Para tasas de calentamiento bajas, la tasa de recuperación es cercana al 0%, alcanzando el 90% para las tasas de calentamiento más altas. Estos resultados deben compararse con el protocolo de Brenner, con solo un 35% para los estadios más favorables (L1-L2) y cerca del 0% para adultos. La línea discontinua no es una interpolación de resultados, sino una línea de tendencia. ( e ) Simulación de elementos finitos de la presión acústica en una sección 2D del experimento. La región de mayor presión acústica, 270 dB, se alcanza en el foco geométrico del transductor. (f) Simulación por elementos finitos del campo de temperatura. en una sección 2D del experimento, después de 60 s de exposición a HIFU. La temperatura más alta se alcanza en el foco. La placa de Petri se coloca invertida, con el rectángulo negro que representa el pozo que contiene los gusanos, para evitar cualquier espacio de aire entre los ultrasonidos y los nematodos. (g) Nematodo muerto después de un recalentamiento insuficientemente rápido (\(<150 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\)). ( h ) Nematodos unas pocas horas después de ser recuperados por calentamiento HIFU. Se aprecian todas las etapas de crecimiento. (i) C. elegans huevo después de la recuperación de los nematodos: su capacidad reproductiva se conserva después de la criopreservación y recalentamiento HIFU.

Tras superar todos los detalles y verificaciones anteriores, pasamos a la fase experimental con C. elegans. Para ello, los nematodos se criopreservaron siguiendo el protocolo estándar de Brenner53 mediante congelación lenta en glicerol al 15%, adaptado a nuestras necesidades. Se enfriaron poblaciones de aproximadamente 200 individuos de todas las etapas de crecimiento a −\(0.6 \; ^\circ{\rm C} /min\), hasta − \(80 \; ^\circ{\rm C}\), dentro de los pocillos construidos en las placas de Petri descritas anteriormente. La cantidad de hielo formado en este sistema se analiza en Información complementaria. Después de 48 h de almacenamiento a − \(80 \; ^\circ{\rm C}\) los nematodos se recalentaron. Para cada experimento siempre había dos platos. La primera placa se recalentó con ultrasonidos, aplicando estos hasta que la temperatura del pozo con los nematodos alcanzó alrededor de −\(5\; ^\circ{\rm C}\) (temperatura que está por encima del punto de fusión de la solución). La evolución de la temperatura a lo largo del proceso se muestra en la Fig. 3a. La segunda placa se recalentó de la manera estándar: ya sea dejándola al aire (velocidad de calentamiento: \(\sim 10 \; ^\circ{\rm C}\)/min) hasta que la solución con los nematodos se descongeló por completo. , o sumergiéndolo en un baño de agua a \(37 \; ^\circ{\rm C}\) (tasa de calentamiento: \(\sim 93 \; ^\circ{\rm C}\)/min) durante 1 minuto. Después de recalentar, los gusanos se colocaron en un plato con comida. Finalmente, se observó la recuperación de estos analizando su movilidad inmediatamente después de depositarlos, su movilidad a las 24 h y su capacidad reproductiva.

Se realizaron un total de 53 experimentos HIFU con más de 10 000 nematodos. La tabla que se muestra en la Fig. 4a muestra la tasa de supervivencia según la tasa de calentamiento y el tiempo de exposición al ultrasonido. Todas las tasas de calentamiento en la Fig. 4 se midieron en el intervalo de − \(60\) a − \(40 \; ^\circ{\rm C}\). Se eligió este intervalo porque es la zona en la que el problema de la recristalización puede ser más crítico43,54.

El transductor de ultrasonido se alimentaba con cuatro potencias diferentes: 13,6 W, 33,9 W, 90,5 W y 134,4 W. Parte de esta energía se disipaba en la electrónica. Las tasas de calentamiento asociadas, medidas por termopares, fueron \(14,2 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\), \(31,7 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min }\), \(157.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) y \(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\), respectivamente. No se pudieron explorar velocidades más altas, ya que esta última es la máxima alcanzable por nuestro sistema actual.

Previo a los resultados presentados a continuación, se llevaron a cabo una serie de experimentos preliminares y exploratorios, determinando la evidencia del beneficio de las altas tasas de calentamiento. Por esta razón, las mayores tasas de calentamiento se estudiaron posteriormente con más detalle: \(157.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) y \(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\). Para ellos se exploró un espectro de tiempos de exposición: 30 s, 40 s, 50 s, 60 s, 70 s y 80 s para \(157.8\;^\circ{\rm C}/min\) y 40 s, 50 s, 60 s, 70 s, 80 s y 90 s para \(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\). Los resultados de estos experimentos se muestran en la Fig. 4b y c. En ambos casos se observa que el tiempo de exposición insuficiente o excesivo al HIFU resultó fatal para la población en estudio.

En la Fig. 4b, correspondiente a una tasa de calentamiento de \(157.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\), podemos ver que para exposiciones de menos de 30 s, 40 s y 50 s, la tasa de recuperación es del 0%. Asciende durante 60 s, y alcanza un máximo en 70 s, volviendo a descender para tiempos de exposición más largos, llegando finalmente al 0% (no representado).

De manera similar, en la Fig. 4c, correspondiente a una tasa de calentamiento de \(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\), para exposiciones de menos de 40 s, la tasa de recuperación es del 0%. A medida que el tiempo de exposición aumenta a 40 s, 50 s y 60 s, la tasa de recuperación aumenta gradualmente, alcanzando un máximo de 70 s. A partir de ese valor para el tiempo de exposición, la tasa de recuperación vuelve a caer hasta llegar a ser cero.

Finalmente, en la Fig. 4d, la supervivencia se representa frente a la tasa de calentamiento para los tiempos de exposición óptimos que se encontraron anteriormente. Este gráfico muestra cómo la tasa de supervivencia parte prácticamente del 0% para las tasas de calentamiento más bajas, sube al 20% para las tasas de calentamiento intermedias (\(157.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\)) y finalmente alcanza el 90% para las tasas de calentamiento más altas (\(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\)).

En cuanto a los adultos, para la configuración óptima, \(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) y tiempo de exposición de 70 s, se dispuso de 3 placas. En cada uno de ellos, como en el resto de placas de este estudio, había unos 200 gusanos, de los cuales unos 20 eran adultos. Tras la aplicación de la ecografía se encontraron 7 adultos en el peor de los casos y 10 en el mejor de ellos, lo que representa una tasa de supervivencia entre el 40 y el 50 % para los adultos, respectivamente. Los videos de los gusanos adultos recuperados se pueden ver en la Información complementaria (Fig. S11). Recuerda que la tasa de recuperación del adulto es cercana al 0% para el recalentamiento lento convencional.

La Figura 4g–i muestra, respectivamente, un detalle de un nematodo muerto por una tasa de calentamiento insuficiente, un grupo de nematodos de todas las edades después de recalentarse en \(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\ ) durante 70 s, y un huevo puesto brevemente después de la recuperación del nematodo.

Para completar, las dos formas de recalentamiento estándar, en un baño a \(37 \; ^\circ{\rm C}\) y en el aire (temperatura ambiente: \(25 \; ^\circ{\rm C} \)), también fueron registrados. En el baño de agua, la supervivencia fue del 0 %, lo que concuerda con los hallazgos de Brenner23 (consulte la información complementaria para conocer la discusión de este resultado). Para el aire, la recuperación fue de alrededor del 35% para L1-L2 y cercana al 0% para adultos, también de acuerdo con nuestros estudios recientes51.

Podemos concluir que estas observaciones prueban, por primera vez, la capacidad de los HIFU para alcanzar las tasas de calentamiento necesarias para evitar el problema de la recristalización en la criopreservación. Las ventajas de esta tecnología son varias: (1) no genera patrones estacionarios como las microondas, (2) no tiene el problema de fuga térmica, (3) puede usarse para muestras ya almacenadas con crioprotectores convencionales, (4) puede ser monitoreada en tiempo real por MRI, (5) puede ser fácilmente controlada por interferometría, (6) se usa rutinariamente en muchos otros campos, lo que representa un gran beneficio, y sobre todo (7) es escalable. Todo esto hace de este enfoque una herramienta prometedora, ya sea solo o en conjunto con otras tecnologías emergentes como el nanocalentamiento39. Los próximos pasos posibles son escalar el número de transductores, usarlos junto con la tomografía computarizada de rayos X para monitorear el campo CPA/hielo/fracturas, y aplicarlos a sistemas que ya han demostrado cierto grado de éxito.

C. elegans se ha utilizado como modelo animal. Pensamos que es un sistema ideal, al tener un conjunto completo de órganos, ser la base de importantes desarrollos en genética, biología del desarrollo, neurociencia u oncología, y una herramienta de trabajo para más de 500 laboratorios en todo el mundo. El uso del gusano aquí es solo para prueba de principio; sin embargo, aun así, puede ser de interés per se para la conservación del estado adulto, para cepas que congelan mal o para estructuras de tamaño similar como el embrión de Drosophila55. En cualquier caso, nuestra técnica ayuda en todas las situaciones en las que puede aparecer el omnipresente problema de la recristalización, incluida la criopreservación de órganos. De su aplicación en este campo, esperamos un cambio de paradigma y nuevos caminos hacia el banco de órganos y tejidos.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Esta investigación ha sido parcialmente financiada por las ayudas: Plan Propio de Investigación de la Universidad de Sevilla y Ministerio de Ciencia y Tecnología (España), AICIA, PEJUS-89 y EQC2019-005949. Agradecemos a Juan José Jiménez por su trabajo con la electrónica. También agradecemos a los revisores anónimos que ayudaron a mejorar la calidad de este manuscrito.

Escuela Superior de Ingenieria, C/Camino de los Descubrimientos s/n, University of Seville, 41092, Seville, Spain

Enrique Alcalá, Laura Encabo, Fatima Barroso, Adriana Puentes & Ramon Risco

SafePreservation, C/Avda. De la Ciencias 55, 41020, Seville, Spain

isabel risco

Centro Nacional de Aceleradores-US, JA, CSIC, C/Tomas Alva Edison 7, 41092, Sevilla, España

Ramón Risco

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RR e IR concibieron la idea de HIFU para evitar la recristalización; EA y LE realizaron el proceso de enfriamiento; EA y AP hicieron el tiro con el ultrasonido; LE y FB mantuvieron los gusanos; EA hizo los diseños en 3D; EA y AP tomaron la determinación de enfoque; EA realizó las simulaciones por computadora. LE y FB prepararon las soluciones; EA y LE hicieron las placas de agar especiales; EA realizó el análisis estadístico; EA, LE, IR y RR escribieron el documento; EA, LE, IR y RR hicieron una lectura crítica del mismo; RR dirigió el equipo.

Correspondencia a Ramón Risco.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Figura complementaria 10.

Figura complementaria 11.

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Reimpresiones y permisos

Alcalá, E., Encabo, L., Barroso, F. et al. Ondas sonoras para solucionar el problema de la recristalización en criopreservación. Informe científico 13, 7603 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34681-z

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Recibido: 20 de diciembre de 2022

Aceptado: 05 mayo 2023

Publicado: 10 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34681-z

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